Содержание вакцинного вирусного антигена в вакцине клещевого энцефалита

Клещевой энцефалит представляет одну из наиболее серьезных проблем инфекционной патологии в РФ. Несмотря на принимаемые меры, заболеваемость КЭ в РФ высока — от 2000 до 3000 больных в год. Одним из эффективных средств борьбы с остается профилактическая прививка от клещевого энцефалита населения, проживающего в регионах его природных очагов [1, 2].

В настоящее время в РФ зарегистрированы шесть вариантов вакцины КЭ: две отечественные (для взрослых и детей с 3-летнего возраста) — вакцина КЭ производства ФГУП «ПИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН», вакцина «Энцевир» производства ФГУП «НПО «Микроген»; и четыре зарубежные – «ФСМЕ-Иммун» (для взрослых и подростков с 16 лет), «ФСМЕ-Иммун–Джуниор» (для детей с 1 года и до 16 лет) — обе производства компании «Бакстер–вакцины», Австрия; «Энцепур взрослый» (для взрослых и подростков с 12 лет), «Энцепур детский» (для детей с 1 года и до 12 лет) — обе производства компании «Новартис–вакцины», Германия.

Таблица 1. Специфическая активность вакцин от клещевого энцефалита по результатам изучения иммуногенной активности на мышах Бальб/С с 2006 по 2010 г.

Примечание: МИД50 — минимальная иммунизирующая доза вакцины; лимит МИД50 по НД: ≤ 0,0125 мл.

Основным показателем качества вакцин КЭ является специфическая активность, определенная в тесте иммуногенности на линейных мышах Балб/С. Сравнительный анализ специфической (иммуногенной) активности при контроле вышеуказанных вакцин в стандартном тесте показывает, что вакцины отечественного производства и вакцины производства компании «Бакстер-вакцины», имеют сходные показатели иммуногенности по МИД50 (минимальная 50% иммунизирующая доза). МИД50 для вакцин компании «Новартис вакцины» выше лимита в 3–5 раз (табл. 1).

Содержание в вакцине вирусного антигена (протективного белка Е) должно быть стандартным. Избыточное содержание вакцинного вирусного антигена может повысить реактогенность вакцины, выражающуюся в появлении температурных реакций от 38°С и выше, головной боли, общем недомогании. Эти явления наблюдаются, как правило, после первой прививки, реже после второй прививки, через 7-8 ч после введения вакцины и проходят на следующий день [3, 4].

Вакцины зарубежного производства: «ФСМЕ-Иммун» (взрослая и детская), «Энцепур» (взрослая и детская) — калиброваны по этому показателю: «ФСМЕ-Иммун» — взрослая — 2,38 мкг/0,5 мл, детская — 1,6 мкг/0,25 мл, «Энцепур взрослый» — 1,5 мкг/0,5 мл, детский — 0,75 мкг/0,25 мл. Данные показатели указаны в инструкциях по применению на эти вакцины. Подбор оптимальной дозы вакцинного антигена проводился при достаточно больших доклинических и клинических исследованиях [2].

Таблица 2. Сравнительное определение титра вакцинного антигена вируса КЭ методом ИФА

Примечания: «ВектоВКЭ-антиген» — производства ЗАО «ВекторБест»; «ИФА ТС АГ ВКЭ» — производства ФГУП «НПО «Микроген».

Отечественные вакцины КЭ по показателю содержания вакцинного вирусного антигена в прививочной дозе не стандартизованы. В связи с этим, целью нашего исследования стала разработка и стандартизация способа количественного определения содержания вакцинного вирусного антигена в вакцине КЭ.

В качестве модели была использована вакцина КЭ «Энцевир», производства ФГУП «НПО «Микроген». Исследования проводились параллельно в ФГБУ «ГИСК им. Л.А. Тарасевича» Минздравсоцразвития России и в НПО «Вирион» – филиале ФГУП «НПО «Микроген» в Томске.

I. Материалы и методы

Материалы:

1. Серии вакцины КЭ «Энцевир» производства ФГУП «НПО Микроген».
2. СОП (стандартный образец предприятия) — приготовлен на предприятии НПО «Вирион» согласно рекомендациям ФГБУ «ГИСК им. Л.А. Тарасевича» для определения вакцинного антигена.
3. Наборы реагентов для иммуноферментного выявления антигена вируса КЭ «ВектоВКЭ-антиген», производства ЗАО «Вектор–Бест», Новоси бирск.
4. Наборы реагентов для иммуноферментного выявления антигена вируса КЭ «ИФА ТС АГ ВКЭ» производства ФГУП «НПО «Микроген».
5. Препарат протективного белка Е вируса КЭ — очищенный жидкий белок Е, партия № 41, с концентрацией белка Е — 160 мкг/мл. Получен из ЗАО «Вектор–Бест». Хранение при температуре минус 70°С.

Методы:

1. Иммуноферментный анализ.
2. Стандартный тест определения специфической активности (иммуногенности) вакцин КЭ при иммунизации линейных мышей Балб/С.
3. Компьютерная программа статистической обработки результатов иммуноферментного анализа методом параллельных линий «Паралайн», разработана докт. биол. наук. В.Г. Петуховым в ФГБУ «ГИСК им. Л.А. Тарасевича» Минздравсоцразвития России [5].

II. Результаты и обсуждение

Сравнительный анализ чувствительности двух наборов реагентов для ИФА при титровании серий вакцин Энцевир» проводился следующим образом.

В предварительных опытах нами была установлена озможность титрования сорбированных вакцин КЭ методом ИФА в наборах реагентов для выявления вакцинного антигена вируса клещевого энцефалита: «ВектоВКЭ-антиген», производства ЗАО «ВекторБест» и «ИФА ТС АГ ВКЭ» производства ФГУП «НПО «Микроген». Наборы реагентов различаются по составу основных реагентов: в первом наборе для выявления антигена вируса КЭ используются только моноклональные антитела к белку Е, штамм № 205 вируса КЭ (как в иммуносорбенте, так и в конъюгате). Во втором наборе реагентов для этой цели используются поликлональные антитела, полученные на основе асцитической жидкости крыс, иммунизированных вирусом КЭ.

Таблица 3. Сравнительное титрование методом ИФА препарата белка Е вируса КЭ и СОП вакцинного антигена

Нами проведено титрование 10 серий вакцины от клещевого энцефалита «Энцевир» в обоих наборах реагентов. Каждая серия вакцины исследовалась в ИФА не менее трех раз. Полученные данные показывают более чем 10-кратное превышение титров антигена при использовании набора реагентов «ВектоВКЭ-антиген» (табл. 2).

В табл. 3 представлены результаты параллельного титрования методом ИФА в обоих наборах реагентов (10 опытов) препарата протективного белка Е вируса КЭ и СОП вакцинного антигена, выполненные в НПО «Вирион». Они подтвердили более высокую чувствительность набора реагентов «ВектоВКЭ-антиген» по сравнению с набором реагентов «ИФА ТС АГ ВКЭ».

Таблица 4. Сравнительные данные по контролю в НПО «Вирион» и аттестации в «ГИСК им. Л.А. Тарасевича» СОП вакцинного антигена вируса КЭ

Примечания: НПО «Вирион», г. Томск — тест система «ИФА ТС АГ ВКЭ», сер. № 020310. «ГИСК им. Л.А. Тарасевича» — набор реагентов «ВектоВКЭ–аниген» ЗАО «Вектор – Бест», г. Новосибирск.

Таблица 5. Изучение стабильности СОП в тесте термодеградации (температура 37°С в течение 7 и 14 сут)

Примечания: даны значения оптической плотности (ОП) каждого разведения СОП.

Таблица 6. Определение концентрации вирусного белка Е в СОП вакцинного антигена (статистическая обработка в программе «Паралайн» результатов титрования в ИФА — данные «ГИСК им. Л.А. Тарасевича»)

Таблица 7. Определение концентрации вирусного белка Е в СОП вакцины КЭ (данные «НПО «Вирион»)

* В каждом измерении исследовали по 1 ампуле.

Таблица 8. Определение концентрации вакцинного антигена (белок Е) в сериях вакцины КЭ «Энцевир» по отношению к СОП антигена (с помощью программы «Паралайн»)

Для получения кандидата в СОП нами использована технология производства серийной продукции очищенной и концентрированной вакцины КЭ «Энцевир». СОП готовили на основе полуфабриката вакцины без добавления стабилизатора (альбумин крови человека) и проведения сорбции антигена на геле алюминия гидроксида. Кандидат в СОП вакцинного антигена вируса КЭ серия № 010810 был приготовлен на основе производственной партии очищенного концентрата № 252 культурального антигена вируса КЭ (производственная партия № 252 вошла в серию вакцины «Энцевир» № 103).

К концентрату культурального вакцинного антигена вируса КЭ № 252 был добавлен в качестве стабилизатора раствор сахарозы 50% (из расчета 50 мг сахарозы на 1 мл концентрата). Материал разлит в ампулы по 0,5 мл и лиофилизирован. Всего было получено 736 ампул, дата изготовления — август 2010 г.

В НПО «Вирион» были проведены испытания кандидата СОП по следующим показателям: внешний вид, точность розлива, потеря в массе при высушивании, герметичность, растворимость, прозрачность и цветность растворенного препарата, рН, содержание общего белка, содержание сахарозы, специфическая активность в ИФА, иммуногенность при иммунизации мышей Бальб/С. Для изучения стабильности и определения срока годности СОП, ампулы были заложены на хранение в течение 1 года при различных температурных режимах. После поступления образцов СОП в «ГИСК им. Л.А. Тарасевича» проведена аттестация образцов по тем же показателям. Сравнительные данные по контролю в НПО «Вирион» и аттестации в «ГИСК им. Л.А. Тарасевича» СОП вакцинного антигена вируса КЭ представлены в табл. 4.

СОП, серия №010810, дополнительно изучен в тесте термодеградации, заключающемся в прогревании образцов СОП при температуре 37oС в течение 7 и 14 сут. Специфическую активность в ИФА образцов СОП после теста термодеградации изучали в сравнении с образцом СОП, хранившимся при температуре от 2 до 8°С. Полученные данные представлены в табл. 5. В результате проведенных исследований СОП вакцинного антигена в ИФА снижения активности не наблюдали. По результатам контроля и аттестации серия СОП № 010810 соответствовала требованиям по всем показателям, на СОП было оформлено Свидетельство и Инструкция по применению.

Определение содержания вирусного белка Е в СОП осуществлялось следующим образом. Основную часть вакцинного антигена вируса КЭ составляет вирусный оболочечный белок Е, обеспечивающий протективные (защитные) свойства вакцины [3].

Очищенный белок Е, партия № 41, был получен из ЗАО «ВекторБест» в сентябре 2010 г. Согласно паспорту на этот препарат, получено 240 мкл с концентрацией белка Е — 160 мкг/мл. Хранение препарата при температуре минус 70oС. Для проведения параллельных титрований СОП и вирусного белка Е готовили предварительное разведение белка Е, основываясь на его исходной концентрации. Разведение 1:1000 готовили на растворе для разведения образцов — РРО из набора реагентов «ВектоВКЭ-антиген». Таким же образом готовили предварительное разведение СОП — 1:128.

Дальнейшие разведения СОП и белка Е готовили также на растворе РРО. В каждом конкретном случае последовательные двукратные разведения готовились из предварительных разведений. Расчет концентрации белка Е в СОП проведен на основе параллельного титрования трех ампул СОП на разных планшетах набора реагентов «ВектоВКЭ-антиген» в разное время.

Для статистической обработки данных, полученных при параллельном титровании вирусного белка Е и СОП, подбирали для этих материалов разведения, имеющие сравнимые показатели оптической плотности (ОП) с линейным падением их значений. По полученным цифровым показателям ОП проводили статистическую обработку методом параллельных линий программы «Паралайн». Устанавливали линейность и параллельность графиков зависимости логарифма дозы от логарифма ОП для вирусного белка Е в СОП, и рассчитывали концентрацию вакцинного антигена (белка Е) в мкг/мл по формуле:

C = M x C x k,

где С — концентрация вирусного белка Е в СОП в мкг/мл; М — активность вирусного белка Е, установленная по программе «Паралайн»; Сs — концентрация вирусного белка Е в соответствующем разведении; k — коэффициент (разведение СОП 1:2048).

Границы 95% доверительного интервала для рассчитанной концентрации С вычисляли по формулам:

Cmin (минимальное отклонение) = Mminx Csx k
и Cmax (максимальное отклонение) = Mmax x Cs x k.

В программу «Паралайн» для вычисления значения М вносили следующие данные: Сs — концентрация белка Е (разведение 1:16000) = 0,01 мкг/мл; К — разведение испытуемого препарата СОП 1:2048; М — вычисляется автоматически по компьютерной программе Паралайн. В соответствии с данными программы «Паралайн» значение М (активность вирусного белка Е) — 0,943 при значениях: min (минимальное стандартное отклонение) — 0,735 и max — (максимальное стандартное отклонение) — 1,213.

С = 0,943 x 0,01 x 2048 = 19,31 мкг/мл;
Сmin = 0,740 x 0,01 x 2048 = 15,15 мкг/мл;
Сmax = 1,21 x 0,01 x 2048 = 24,78 мкг/мл.

В результате проведенных статистических исследований установлено, что среднее значение содержания вирусного белка Е в СОП составило 9,26 мкг/0,5 мл (табл. 6). Подобные результаты были получены в НПО «Вирион» — содержание белка Е в СОП составило 8,46 мкг/0,5 мл (табл. 7).

Установленная концентрация белка Е в СОП вакцинного антигена вируса КЭ позволила подойти к определению содержания протективного антигена (вирусного белка Е) в сериях вакцины КЭ «Энцевир». Для изучения были подобраны 8 серий вакцины:

• серии № 71, № 72, № 75, № 77: содержание общего белка — от 9,0 мкг/0,5 мл до 9,5 мкг/0,5 мл;
• серии № 90, № 91, № 93, № 95: содержание общего белка — от 5,0 мкг/0,5 мл до 6,0 мкг/0,5 мл.

Проведено параллельное титрование серий вакцины «Энцевир» по отношению к СОП вакцинного антигена вируса КЭ. Титрование каждой серии вакцины «Энцевир» методом ИФА проводилось не менее 3 раз. Показано, что в сериях вакцины, содержавших при контроле меньшее количество общего белка (№ 90, 91, 93, 95), определялась более низкая концентрация белка Е — 2,99 мкг/амп (среднее значение) по сравнению с сериями № 71, 72, 75, 77 — среднее значение вирусного вакцинного антигена по белку Е — 4,91 мкг/амп (табл. 8).

Выводы:

1. Разработан и стандартизован способ количественного определения содержания вакцинного вирусного антигена (белок Е) в вакцине клещевого энцефалита.
2. Разработан и аттестован СОП вакцинного антигена вируса КЭ соответствующий требованиям стандартизации к СОП; оформлены свидетельство и инструкция по применению СОП.
3. СОП вакцинного антигена вируса КЭ калиброван по содержанию вирусного протективного белка Е.

Литература

1. Злобин В.И. Современные проблемы эпидемиологии и профилактики клещевого энцефалита в Российской Федерации // Биопрепараты. — 2004. — № 2 (14). — С. 4–7.
2. Кунц К. Австрийский опыт вакцина — вакцинации против клещевого энцефалита // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. — 2004. — № 1. — С. 37–41.
3. Локтев В.Б., Терновой В.А., Нетесов С.В. Молекулярно-генетическая характеристика вируса клещевого энцефалита // Вопросы вирусологии. — 2007. — № 5. — C. 10–16.
4. Воробьева М.С., Ладыженская И.П., Расщепкина М.П. и др. Оценка качества отечественных иммуноферментных тест-систем для ранней диагностики КЭ // Материалы расширенного пленума проблемной комиссии «Клещевой и другие вирусные энцефалиты» РАМН, 9-10 декабря 2003 г. — М., 2003. — С. 53–54.
5. Петухов В.Г., Свидетельство об официальной регистрации программы для ЭВМ «Паралайн», 2006.